Aktuelle Projekte
Der saprotrophe Pilz Trichoderma reesei wird für die industrielle Herstellung von Kohlenhydrat-aktiven Enzymen genutzt, die ihrerseits in vielen industriellen Bereichen Anwendung finden. Unerfreulicherweise kommt es vor, daß Topproduktionsstämme während eines Fermentationslaufes plötzlich ihre Produktivität einbüßen. Eine derartige spontane Degeneration von mikrobiellen Produktionsstämmen ist nicht auf T. reesei beschränkt, sondern ein durchaus verbreitetes Phänomen, das äußerst nachteilig für biotechnologische Prozesse ist. Leider kann derzeit eine solche unerwartete Degeneration nicht verhindert werden und wird im mechanistischem Sinne auch nicht wirklich verstanden. Gemäß Untersuchungen der beiden Antragsteller (TU Wien und Novozymes) wird die Stammdegeneration durch cis epigenetische Vorgänge bewirkt, die mit einer Verdichtung des Chromatins einhergehen, das wiederum im Zusammenhang mit Veränderungen in der Histonmodifikation steht. Weiters gibt es deutliche Hinweise auf DNA-Methylierung von Regionen, die übergeordnet des zentralen Transaktivators der Enzymexpression angesiedelt sind, als eine der eigentlichen Ursachen für dieses Phänomen. Die Veränderungen in der Physiologie des Pilzes sowie seiner Genexpression, die mit dem Auftreten der degenerierten Zellpopulation einhergehen, können letztlich der Aktion von Proteinen zugeordnet werden, die für Verschiebungen in der epigenetischen Landschaft der Pilzzelle verantwortlich sind. Es sollen diese Mediatoren sowie deren Ziele identifiziert werden, um in weiterer Folge entsprechende gezielte Modifikationen an diesen vornehmen zu können, die optimalerweise zu Strategien beruhend auf synthetischer Biologie führen, die es erlauben, stabile Produktionsstämme zu erhalten.
Neben klassischer Genregulation durch Transkriptionsfaktoren werden heutzutage nichtkodiernende (nc) RNAs als zentrale regulatorische Elemente in der Zelle betrachtet. Obwohl es Hinweise auf die Existenz von ncRNAs in niederen Eukaryonten – wie es beispielsweise industriell genutzte Pilze sind - gibt, wurde in diesen bis jetzt weder über grundlagenwissenschaftliche Studien noch über entsprechende Anwendungen von ncRNAs berichtet. Der universitäre Partner verfügt seit kurzem über Forschungsergebnisse, die belegen, dass eine lange ncRNA (genannt HAX1) als ein Aktivator für die Enzymexpression in T. reesei fungiert und dass sich diese Funktion im Zuge der auf Zufallsmutagenese beruhenden Stammentwicklung verstärkt haben dürfte. Die dabei stattgefundene Evolution von HAX1 bezieht sich vor allem auf seine Länge und damit auch auf Strukturänderungen. Allerdings müssen auch Punktmutationen, die Änderungen in der Struktur und/oder der Stabilität von HAX1 bewirken können, sowie Änderungen in seinem Expressionsverhalten in Betracht gezogen und untersucht werden. Beruhend auf solchen Erkenntnissen sollen synthetische HAX1 Versionen, die aus Fusionen der verschieden evolvierten HAX1 Versionen bestehen, kreiert werden. Eine weitere Basis für die Synthese von artifiziellen HAX1 Versionen sind serielle Basenpermutationsanalysen. Letztlich sollen Expressionskassetten für HAX1 entwickelt werden, die direkt in jedweden Stamm, der für einen Anwender von Interesse ist, in einem einzigen Schritt eingebracht werden können und zur unmittelbaren Erhöhung der Enzymproduktion führen.
Kontakt:
Senior Scientist Dipl.-Ing. Dr.techn. Astrid Mach-Aigner, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster
Pilze sind für die Herstellung von vielen Naturstoffen und so auch für die Produktion von Sekundärmetaboliten verantwortlich. Die Diversität dieser Substanzen resultiert einerseits aus einer großen Vielzahl von Pilzspezies sowie unterschiedlichster Biosynthesewege für deren Produktion. In den letzten Jahrzehnten wurden zahlreiche dieser Produkte identifiziert und viele davon werden heute von der Biotech- und Pharmaindustrie genutzt.
Nichtdestotrotz ist die große Mehrzahl dieser Naturstoffgruppe noch unbekannt und harrt ihrer Entdeckung. Zwei Hauptherausforderungen begrenzen den Zugang zu neuen Verbindungen: i) das Unvermögen, diverse Produzenten von Sekundärmetaboliten im Labor zu kultivieren, und ii) die Tatsache, dass ein Großteil der Sekundärmetabolismus bezogenen Biosynthesegene und Gencluster unter Standardlaborbedingungen stumm sind, also nicht abgelesen werden. Um diese Hindernisse zu überwinden werden viele Strategien, einschließlich jener der Identifikation und Manipulation von pleiotropen Regulatoren des Sekundärstoffwechsels, verfolgt.
Die Antragsteller und deren Teams haben vor kurzem einen Transkriptionsfaktor isoliert und vorcharakterisiert, der als pleiotroper, negativer Regulator der Sekundärmetaboliten Biosynthese fungiert. Erste Ergebnisse verdeutlichen, seine Schlüsselrolle in der Sekundärmetabolitenproduktion im filamentösen Pilz Trichoderma reesei. Dieser in trans agierende Faktor ist aber auch in einer Vielzahl von biotechnologisch und landwirtschaftlich relevanten Pilzspezies zu finden. Basierend auf diesen Ergebnissen werden im Projekt folgende Untersuchungen durchgeführt: i) Aufklärung des Regulons dieses Faktors in T. reesei, ii) Analysieren seiner regulatorischen Funktion im Biokontrolle aktiven Pilz T. atroviride, den pflanzenpathogenen Pilzen Fusarium graminearum und F. fujikuroi und dem pharmakologisch genutzten Pilz Claviceps purpurea, iii) Untersuchung der molekularen Mechanismen über welche er seine regulatorische Funktion in T. reesei ausübt.
Funding:
FWF, project number P29556, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster
Kontakt:
Univ. Prof. Dr. Robert Mach, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster
Sekhmet’s Geschenk ist eine neuartige Methode zur kostengünstigen und nachhaltigen Produktion von Medikamenten. Dafür werden ungenutzte pflanzlich Biomasse und ein industriell etablierter Pilz verwendet und die Abfallströme des Prozesses vollständig genutzt.
Kontakt:
Senior Scientist Dipl.-Ing. Dr.techn. Astrid Mach-Aigner, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster
Biotreibstoffe der zweiten Generation („Lignozelluloseethanol“) sind eine vielversprechende Alternative zu klassischen fossilen Energiequellen und konkurrieren im Gegensatz zu diesen dessen nicht mit der Versorgung an Nahrungs- und Futtermitteln, noch benötigen sie zusätzliche landwirtschaftliche Nutzflächen. Dieser Vorteil beruht darauf, dass die verwendeten Rohmaterialien lignozellulosehältige Bioabfälle (LBA) sind.
Lignozellulose ist der weltweit am häufigsten vorkommende nachwachsende Rohstoff und häuft sich als Abfallprodukt in der Landwirtschaft (z.B. Getreidestroh, Maisstiele, Sojabohnenreste und Bagassse), der Industrie (z.B. der Papierindustrie), der Forstwirtschaft und Holzverarbeitung an und ist in kommunalem Abfall enthalten. Lignozellulose hat schätzungsweise einen ca. Anteil von 50 % an der weltweit vorhandenen Biomasse (dies entspricht 10 – 50 Mrd. Tonnen). Diese Menge ist mehr als ausreichend um den Bedarf an diesem Rohstoff für die Chemikalien-, Materialen- und Treibstoffherstellung zu decken.
Ein kommerzieller Biotreibstoff/Bioraffinerieprozess ist mehrstufig: i) physikalische und/oder chemische Vorbehandlung der LBA (zur Ligninabtrennung und Erhöhung der Wasserlöslichkeit), ii) enzymatische Hydrolyse der LBA (zur Depolymerisierung der (Hemi)zellulose) und iii) Vergärung der so erhaltenen Monosaccharide zu Ethanol.
Die Menge an hydrolytischen Enzymen, die für eine effiziente Hydrolyse von LBA benötigt wird, ist sehr hoch und daher ein kritischer Faktor für die Rentabilität des Produktionsprozesses. Einer der meistverwendeten Organismen zur industriellen Herstellung dieser Enzyme ist der filamentöse Pilz Trichoderma reesei. Derzeit benötigen entsprechende biotechnologische Verfahren den Zusatz von induzierenden Substanzen zum Fermentationsmedium von T. reesei zur Aktivierung der Enzymherstellung im Pilz. Diese Induktorsubstanzen müssen in einem weiteren Prozess erzeugt werden, was eine erhebliche Kostensteigerung bewirkt. Darüber hinaus hemmen Glukose und hohe D-Xylosekonzentrationen (die dominanten Endprodukte der Hydrolyse von LBA) die Enzymproduktion, sogar in Stämmen bei denen die Cre1-vermittelte Kohlenstoffkatabolit-repression eliminiert wurde. Im vorgeschlagenem Projekt sollen diese Nachteile ausgeräumt werden. Konkret ist geplant einen chimären Transaktivator bzw. eine synthetische Signaltransduktionskaskade auf Basis des Xylanase Regulators 1 aus T. reesei, dem humanen Östrogenrezeptor und dem LexA Operator aus Escherichial coli zu konstruieren. Die rekombinanten Stämme, die diesen Faktor bzw. diese Kaskade beinhalten, erlauben es: i) auf eine billigere Induktorsubstanz (Estradiol) zurückzugreifen, ii) wodurch außerdem der zusätzliche Prozessschritt der Induktorerzeugung entfällt, iii) eine Produktion von LBA-hydrolysierenden Enzymen entkoppelt von Kohlenstoffkatabolitrepression, iv) und damit die Verwendung von billigen Kohlenstoffquellen (z.B. Lignocellulosehydrolysate bestehend aus Glukose, D-Xylose und L-Arabinose) für die Produktion von LBA-hydrolysierenden Enzymen.
Funding:
FWF, project number P26733, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster
Kontakt:
Senior Scientist Dipl.-Ing. Dr.techn. Astrid Mach-Aigner, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster
In der letzten Dekade wurde das Spektrum der klassischen Funktionen nicht kodierender RNAs (ncRNAs) auf zusätzliche Aspekte der Zellbiologie erweitert. Als eine der treibenden Kräfte in diesem Forschungsfeld ist die molekularbiologische Forschung in der Humanmedizin anzusehen. Jüngste Untersuchungen zeigten, dass zusätzlich zur klassischen Genregulation durch Transkriptionsfaktoren unterschiedliche ncRNAs als regulatorische Schlüsselelemente in der Zelle fungieren. So konnte gezeigt werden, dass ncRNAs in unterschiedlichste Aspekte der Zellbiologie involviert sind, die sich von der Embryonalentwicklung bis hin zur Tumorgenese erstrecken. Obwohl es gute Hinweise für die Existenz von ncRNAs in niederen Eukaryonten wie zum Beispiel filamentartigen Pilzen gibt, wird kaum entsprechende Forschung in biotechnologisch relevanten Mikroorganismen betrieben, noch sind Berichte über etwaige Anwendungen beispielsweise in industriell genutzten Pilzen bekannt.
In diesem Projekt ist die vor kurzem im Team des Projektinitiators isolierte und grob vorcharakterisierte ncRNA bezeichnet als HAX1, also als der „hypothetischen Aktivator von Xyr1 (Xylanaseregulator 1)“, Forschungsgegenstand. Ihre Struktur, die molekulare mechanistische Wirkungsweise und ihre Funktion in der Regulation der Genexpression werden bestimmt. Im Besonderen wird das Ausmaß der Beteiligung von HAX1 an der Expression und Produktion von pflanzenzellwandabbauenden Enzymen in Trichoderma reesei untersucht. Die resultierenden Ergebnisse sollen zum einen tieferen Einblick in die regulatorischen Zusammenhänge der Genexpression in niederen Eukaryonten geben und zum andern einen völlig neuen Zugang der gerichteten Belastungsverbesserung von industriell wichtigen, filamentartigen Pilzen eröffnen.
Funding:
FWF, project number P26618, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster
Kontakt:
Ao.Univ.Prof. Mag. Dr.rer.nat. Robert Mach, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster
Trichoderma reesei wird von der Industrie als Produktionsorganismus von Zellulasen und Hemizellulasen verwendet, die zur Hydrolyse von Pflanzenzellwandpolysacchariden dienen. In den vergangenen Jahrzehnten wurden (Hemi-)Zellulasen bereits erfolgreich von verschiedenen Industriezweigen wie der Nahrungs- und Futtermittelindustrie sowie der Textil-, Zellstoff- und Papierindustrie eingesetzt. Neuerdings werden sie auch erfolgreich zur Erzeugung von klimaneutralen Treibstoffen und Plattformchemikalien in sogenannten fortgeschrittenen Bioraffinerien verwendet. Bei diesen Verfahren werden - an Stelle von Nahrungsmitteln Agrar-reststoffe wie Stroh, Hausmüll oder Energiepflanzen als Rohstoffe eingesetzt. Diese Art der Biomasse ist allerdings notorisch schwierig zu verzuckern und ökonomische Prozesse erfordern neben effizienter Aufschlussverfahren auch kostengünstige (Hemi-)zellulasepräparate. Aus diesem Grund sind Untersuchungen zur verbesserten und effizienteren Produktion dieser Enzyme besonders wichtig für die Etablierung einer biobasierten Ökonomie.
Im Rahmen von akademischen und industriellen Stammverbesserungsprogrammen konnte in den letzten 50 Jahren die Hemizellulaseproduktion von T. reesei durch ungezielte Mutation um etwa zwei Größenordnungen verbessert werden. Berichte über gezielte gentechnische Stammverbesserung sind aber bislang rar und die so erzeugten Stämme können bisher nicht mit den ungezielt verbesserten Stämmen konkurrieren. Gezielte Eingriffe ins Erbgut der Produktionsstämme sind allerdings wesentlich effizienter und vermeiden außerdem das Risiko von nachteiligen ungezielten Mutationen, die während der ungezielten Mutagenese entstehen können. Mittlerweile sind die Genomsequenzen etlicher Stämme, die durch ungezielte Mutagenese erzeugt wurden, entschlüsselt. Ziel dieses Projekt ist es, die für die Verbesserung der Zellulaseproduktion relevanten Mutationen zu entschlüsseln und diese Erkenntnisse in der nächsten Generation von Produktionsstämmen einzubringen.
Funding:
FWF, project number P24219, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster
Kontakt:
Piv. Doz. Dr. Bernhard Seiboth, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster
Trichoderma reesei ist ein wichtiger Produzent industriell angewandter Enzyme. Konventionelle Stammverbesserung durch Mutagenese und Selektion hat zu Produktionsstämmen geführt, die mehr als 100 g/l homologes Protein sekretieren. Die Gründe für diese Proteinhyperproduktion sind nur teilweise bekannt und vor allem die Produktionslevels heterologer Proteine sind viel geringer. Ein Nachteil dieser Produktionsstämme ist auch, dass sie durch die Mutagenese eine Vielzahl negativer Mutationen angesammelt haben, die die Fitness der Stämme beeinträchtigt. Ziel dieses Projektes ist es daher Produktionsstämme auf rekombinanter Basis zu designen, die die momentan möglichen Proteinproduktionslevels erreichen und sogar übertreffen können. Dazu werden verschiedene industriell relevante Stammlinien mit state of the art Techniken wie Vergleichende Genomik, Transkriptomik und Proteomik untersucht. In Kombination mit neu entwickelten und verbesserten molekularen und genetischen Techniken werden Stämme für eine effiziente Proteinproduktion entwickelt.
Partner:
THE AUSTRIAN CENTRE OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster
Kontakt:
Piv. Doz. Dr. Bernhard Seiboth, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster
Dieses Projekt ist durch ein Community Science Program (CSP) des Department of Energy Joint Genome Instituts gefördert. Innerhalb des Projektes werden die transkriptionellen und enzymatischen Reaktionen der 3 Pilze Podospora anserina, Aspergillus niger und Trichoderma reesei auf verschiedene Pflanzenrohstoffe untersucht, um deren unterschiedliche Strategien zur Nutzung der Pflanzenbiomasse zu identifizieren.
Partner:
Adrian Tsang (Concordia University)
Kontakt:
Priv. Doz. Dr. Bernhard Seiboth, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster