Motivation

Infrarotspektroskopie ist eine etablierte Technik für die Analyse von Polypeptiden und Proteinen. Die Amid I  (1700-1600 cm^-1) und die Amid II-Bande (1600-1500 cm^-1) sind die aussagekräftigsten Banden für die Identifizierung der Sekundärstruktur und die Quantifizierung von Proteinen.

Die starke Absorption der HOH Biegeschwingung bei 1640 cm^-1 erschwert IR spektroskopische Untersuchungen von Proteinen in wässrigen Lösungen. Für die konventionelle Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie sind sehr kurze Schichtdicken im Bereich von ca. 10 µm erforderlich, um eine vollständige Absorption des IR Lichts im Spektralbereich des Wassers zu vermeiden. Diese geringen Schichtdicken verringern die Intensität der IR-Banden und das Signal-Rausch-Verhältnis, wodurch die Anwendung auf hohe Proteinkonzentrationen (ca. 10 mg/mL) beschränkt ist.

EC-QCLs verfügen über eine um mehrere Größenordnungen höhere spektrale Leistungsdichte als thermische Strahler und ermöglichen die Verwendung einer 4-5-fach höheren Transmissionsschichtdicke und folglich den Nachweis von Proteinen bei niedrigeren Konzentrationen.

Entwicklung von Laser-basierten IR Transmissions Setups zur Proteinanalyse

In den letzten Jahren wurden mehrere Versionen von EC-QCL-basierten IR-Transmissions Setups zur Analyse der Amid I- und Amid II-Banden von Proteinen entwickelt. Die neueste Iteration basiert auf Balanced Detection und bietet bei Messzeiten von nur unter 1 Minute verbesserte Nachweisgrenzen im Vergleich zu high-end FT-IR Spektrometern.

Publikationen:

• Broadband laser-based mid-infrared spectroscopy employing a quantum cascade detector for milk protein analysis, Sensors and Actuators B-Chemical, 2022.
• The next Generation of IR Spectroscopy: EC-QCL based mid-IR Transmission Spectroscopy of Proteins with Balanced Detection, Analytical Chemistry, 2020.
• Beyond FT-IR spectroscopy: EC-QCL based mid-IR transmission spectroscopy of proteins in the amide I and amide II region, Analytical Chemistry, 2018.
• External cavity-quantum cascade laser spectroscopy for mid-IR transmission measurements of proteins in aqueous solution, Analytical Chemistry, 2015.

Buchkapitel:

• Quantum cascade laser-based infrared transmission spectroscopy of proteins in solution, Vibrational Spectroscopy in Protein Research, 2020.

Inline-Analyse von Proteinen in der präparativen Flüssigkeitschromatographie

Ein kommerzieller EC-QCL Spektrometer (Chemdetect Analyzer von Daylight Solutions) wurde für die Inline-Analyse von Proteinen in der präparativen Ionenaustauschchromatographie (IEX) und der Größenausschluss-Spektroskopie (SEC) eingesetzt.

Publikationen:

• QCL-IR Spectroscopy for In-Line Monitoring of Proteins from Preparative Ion-Exchange Chromatography, Analytical Chemistry, 2022.
• Laser-based mid-infrared spectroscopy enables in-line detection of protein secondary structure from preparative liquid chromatography, SPIE Proceedings, 2022.
• Broadband laser-based mid-IR spectroscopy for analysis of proteins and monitoring of enzyme activity, Spectrochimica Acta Part A, 2021.

Verfolgung von Änderungen der Protein-Sekundärstruktur nach externer Anregung

Die entwickelten Setups wurden zur Verfolgung von Konformationsänderungen in der Protein-Sekundärstruktur nach verschiedenen Arten externer Anregung eingesetzt. 

Publikationen:

pH titration of β-lactoglobulin monitored by laser-based Mid-IR transmission spectroscopy coupled to chemometric analysis, Spectrochimica Acta A, 2020., öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster

External cavity-quantum cascade laser infrared spectroscopy for secondary structure analysis of proteins at low concentrations, Nature Scientific Reports, 2016., öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster

EC-QCL mid-IR transmission spectroscopy for monitoring dynamic changes of protein secondary structure in aqueous solution on the example of beta-aggregation in alcohol-denaturated alpha-chymotrypsin, Analytical Bioanalytical Chemistry, 2016., öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster

Konzentrationsbestimmung einzelner Proteine in kommerzieller Kuhmilch 

QCL-IR-Spektroskopie wurde zur Quantifizierung der wichtigsten Proteine in kommerzieller Kuhmilch eingesetzt. Die Auswertung der Konzentrationen der temperaturempfindlichen Proteine Beta-Lactoglobulin und Alpha-Lactalbumin ermöglicht die Unterscheidung zwischen verschiedenen Milchtypen.  

Publikationen:

• High-throughput quantitation of bovine milk proteins and discrimination of commercial milk types by external cavity-quantum cascade laser spectroscopy and chemometrics, Analyst, 2019.
• Fast quantification of bovine milk proteins employing external cavity-quantum cascade laser spectroscopy, Food Chemistry, 2018.
• External cavity-quantum cascade laser (EC-QCL) spectroscopy for protein analysis in bovine milk, Analytica Chimica Acta, 2017.

MitarbeiterInnen:

Shilpa Vijayakumar

Alicja Dabrowska

Georg Ramer