Protein-Micropatterning in der Plasmamembran lebender Zellen

In den letzten Jahren haben wir eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, spezifische Membranproteine in Form von Mikro- oder Nanostrukturen einstellbarer Größe direkt in der Plasmamembran lebender Zellen anzuordnen.

Auf diese Weise können wir innerhalb derselben Zellmembran Bereiche erzeugen, die mit dem gewünschten Protein angereichert oder verarmt sind. Derzeit wenden wir diese Methode an, um i) biomolekulare Interaktionen in der Plasmamembran lebender Zellen zu messen und ii) die hydrodynamische Größe von Membranproteinen zu quantifizieren.

Um die Mikromuster zu erzeugen, stellen wir zunächst Streptavidin-Muster mit einstellbarer Geometrie auf Glasträgern mittels Mikrokontaktdruck her. Um die Zelladhäsion zu fördern und die nicht beschichteten Teile der Oberfläche zu passivieren, werden die Zwischenräume mit Fibronektin gefüllt. Schließlich wird ein biotinylierter Antikörper, der spezifisch für den exprimierten GFP-gekennzeichneten Köder ist, an Streptavidin gebunden. Auf diese Weise lassen sich Antikörpermuster mit Größen von typischerweise 3 µm bis hinunter zu 80 nm erzeugen. Zellen, die den GFP-markierten Köder exprimieren, lässt man auf solchen Oberflächen anwachsen, was zu einer spezifischen Immobilisierung des Köders führt.

Wissenschaftliches Bild, das die Mikrostrukturierung von Membranproteinen veranschaulicht

© TU Wien

Mikrostrukturierungsmethode

Mikrostrukturierung von Membranproteinen in der Plasmamembran lebender Zellen. PDMS-Stempel werden mit Streptavidinlösung eingefärbt (i), gewaschen (ii) und auf Glasträger übertragen (iii). Nach dem Auffüllen mit Fibronektin (iv) werden die Objektträger mit einem biotinylierten Fänger-Antikörper gegen das gewünschte Protein (GFP-tagged bait) inkubiert.

Messung biomolekularer Wechselwirkungen in der Plasmamembran lebender Zellen

Die Charakterisierung und insbesondere die Quantifizierung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen ist normalerweise kein einfaches Unterfangen. Wir haben eine einfache Methode entwickelt, um die Interaktion zwischen einem Membranprotein ("Köder") und einem fluoreszenzmarkierten Interaktionspartner ("Beute") (membrangebunden oder zytosolisch) in lebenden Zellen mit Hilfe der Totalreflexionsfluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie zu identifizieren und zu quantifizieren. Das Köderprotein wird innerhalb von Mustern in der Plasmamembran immobilisiert (z. B. über einen Antikörper); die Stärke der Köder-Beute-Interaktion kann durch Bestimmung der Fluoreszenzintensität der Beute im Verhältnis zu den Ködermustern quantifiziert werden. Diese Methode eignet sich besonders für die Analyse schwacher, flüchtiger Wechselwirkungen, die mit anderen Methoden nicht leicht zugänglich sind.

Wissenschaftliche Abbildung über das Prinzip der Protein-Mikrostrukturierung in der Plasmamembran

Prinzip der Protein-Mikrostrukturierung in der Plasmamembran

(A) Skizze und (B) TIRF-Bild einer Zelle, die auf einem mikrostrukturierten Substrat gewachsen ist. Der Köder-Antikörper ist in einem regelmäßigen Muster aus 3 μm großen Punkten mit 3 μm Zwischenraum angeordnet. Das (unmarkierte) Köderprotein reorganisiert sich entsprechend den Antikörpermustern, aber das fluoreszenzmarkierte Beuteprotein ist homogen in der Plasmamembran verteilt, was auf keine Wechselwirkung zwischen Köder- und Beuteprotein hinweist. Maßstabsbalken ist 7 μm. (C, D) Wie in (A, B), aber hier interagiert das Beuteprotein stark mit dem Köderprotein und lokalisiert entsprechend mit den Ködermustern. Der Zellumriss ist durch eine gestrichelte weiße Konturlinie gekennzeichnet.

Quantifizierung der hydrodynamischen Größe von Membranproteinen

Wir verwenden den Mikrostrukturierungsansatz auch zur Untersuchung der Größe von Plasmamembranproteinen: Ein Interaktionspartner (Hindernis) wird immobilisiert, und der Einfluss auf die Diffusionsbewegung des anderen Partners (Tracer) wird bewertet. Mit Hilfe des Mikrokontaktdrucks können wir routinemäßig Dichten von immobilisierten Hindernissen von bis zu 10.000 Molekülen pro µm² erzeugen, was einem durchschnittlichen Abstand der nächsten Nachbarn von 10 nm entspricht. Bei der Verwendung von GPI-verankerten Proteinen sowohl als Hindernis als auch als Tracer konnten wir eine Verringerung der Tracer-Mobilität um bis zu 50 % allein durch die Anwesenheit der immobilisierten Hindernisse beobachten. Eine wesentlich stärkere Verringerung der Diffusionsbewegung bis hin zur vollständigen Arretierung des Tracers könnte erreicht werden, wenn größere Proteinkomplexe als Tracer verwendet würden. Die Größe von Tracer und Hindernis lässt sich anhand der Abhängigkeit des Mobilitätsverhältnisses DON⁄DOFF von der Hindernisdichte quantifizieren.

Wissenschaftliche Abbildung zeigt Protein-Mikrostrukturierung und Analyse

Protein-Mikrostrukturierung und Analyse

(A) zeigt ein Fluoreszenzbild der Hindernisverteilung - hier mGFP-GPI - in einer lebenden T24-Zelle. (B) Für die Analyse werden die Diffusionskonstanten des Tracers durch Einzelmolekülverfolgung bestimmt, sowohl in den mit Hindernissen angereicherten ("ON") als auch in den abgereicherten ("OFF") Regionen der Plasmamembran.

Unsere wichtigsten Publikationen

A Fast and Simple Contact Printing Approach to Generate 2D Protein Nanopatterns

Lindner, M., A. Tresztenyak, G. Fülöp, W. Jahr, A. Prinz, I. Prinz, J. G. Danzl, G. J. Schütz, and E. Sevcsik. 2019. A Fast and Simple Contact Printing Approach to Generate 2D Protein Nanopatterns. Front. Chem. 6(655), öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster.

Mit einem speziellen zusammengesetzten Stempel konnten wir die erreichbare Strukturgröße auf 80nm reduzieren.

A Micropatterning platform for quantifying interaction kinetics between the T cell receptor and an intracellular binding protein

Motsch, V., M. Brameshuber, F. Baumgart, G. J. Schütz, and E. Sevcsik. 2019. A micropatterning platform for quantifying interaction kinetics between the T cell receptor and an intracellular binding protein. Scientific Reports 9(1):3288, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster.

Wir haben den Ansatz des Micropatterning verwendet, um die Kinetik des ZAP-70-Austauschs auf dem TCR-Komplex zu messen.

Protein Micropatterning Assay: Quantitative Analysis of Protein–Protein Interactions

Schütz G.J., Weghuber J., Lanzerstorfer P., Sevcsik E. 2017. Protein Micropatterning Assay: Quantitative Analysis of Protein–Protein Interactions. Methods in Molecular Biology 1550: 261-270

Hier geben wir einen Leitfaden für die Durchführung eines Micropatterning-Experimentes, beschreiben mögliche Probleme und schlagen Lösungen vor.

Monte Carlo simulations of protein micropatterning in biomembranes: effects of immobile sticky obstacles

Arnold, A. M., E. Sevcsik, and G. J. Schütz. 2016. Monte Carlo simulations of protein micropatterning in biomembranes: effects of immobile sticky obstacles. Journal of Physics D: Applied Physics 49(36):364002, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster.

In dieser theoretischen Publikation haben wir den Einfluss von unbeweglichen, haftenden Fremdkörpern auf das Mobilitätsverhältnis DON/DOFF, wie es in einem micropatterning Experiment gemessen wird, näher untersucht. Wir verwenden dieses Paper als Grundlage für unsere Analyse von Micropatterning-Experimenten.

GPI-anchored proteins do not reside in ordered domains in the live cell plasma membrane

Sevcsik, E., M. Brameshuber, M. Fölser, J. Weghuber, A. Honigmann, and G. J. Schütz. 2015. GPI-anchored proteins do not reside in ordered domains in the live cell plasma membrane. Nat Commun 6:6969, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster.

Hier haben wir einen potenziellen Lipid-Raft-Marker in Mikromustern angeordnet und den Einfluss auf die Diffusionseigenschaften anderer Membranbestandteile quantifiziert. Im Gegensatz zu früheren Annahmen, konnten wir die Existenz einer flüssigen geordneten Phase nicht feststellen

Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surface

Julian Weghuber, Mario Brameshuber, Stefan Sunzenauer,Manuela Lehner, Christian Paar, Thomas Haselgrübler, Michaela Schwarzenbacher, Martin Kaltenbrunner, Clemens Hesch, Wolfgang Paster, Bettina Heise, Alois Sonnleitner, Hannes Stockinger, and Gerhard J. Schütz. 2010. Detection of Protein–Protein Interactions in the Live Cell Plasma Membrane by Quantifying Prey Redistribution upon Bait Micropatterning. Methods in Enzymology 472: 133-151, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster.
and
Julian Weghuber, Stefan Sunzenauer, Mario Brameshuber, Birgit Plochberger, Clemens Hesch, Gerhard J. Schütz. 2010. In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces. Journal of Visualized Experiments 37.

Wir beschreiben hier ein detailliertes Protokoll für das Design und die Herstellung des Micropatterning-Systems zum Nachweis und zur Quantifizierung von Wechselwirkungen zwischen einem Fluorophor-markierten Protein (''Prey'') und einem Membranprotein (''Bait'') in lebenden Zellen.

Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells

Schwarzenbacher, M., M. Kaltenbrunner, M. Brameshuber, C. Hesch, W. Paster, J. Weghuber, B. Heise, A. Sonnleitner, H. Stockinger, and G. J. Schütz. 2008. Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells. Nat Methods 5(12):1053-1060, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster.

Unsere erste Publikation über Micropatterning. Wir haben den Ansatz vorgestellt, indem wir die Interaktion zwischen CD4 (Coreceptor in der T-Zell-Signalgebung) und Lck (Schlüsselkinase in der frühen T-Zell-Signalgebung) untersucht haben.

Weitere Lektüre

Full control of ligand positioning reveals spatial thresholds for T cell receptor triggering

Cai, H., J. Muller, D. Depoil, V. Mayya, M. P. Sheetz, M. L. Dustin, and S. J. Wind. 2018. Full control of ligand positioning reveals spatial thresholds for T cell receptor triggering. Nature Nanotechnology 13:610–617, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster.

Der TCR wurde mit Hilfe einer nanofabrizierten Einzelmolekül-Array-Plattform in verschiedenen Nanomustern angeordnet. Es wurden deutliche Unterschiede in der T-Zell-Signalgebung beobachtet, die vom lateralen Abstand zwischen den Liganden abhingen.

Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function

Shen, K., V. K. Thomas, M. L. Dustin, and L. C. Kam. 2008. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proc Natl Acad Sci U S A 105(22):7791-7796, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster.

In dieser Publikation wurden zwei für die T-Zell-Signalgebung relevante Proteine mittels Micropatterning in unterschiedlichen Konfigurationen angeordnet, was erste Hinweise auf räumliche Anforderungen bei der Präsentation von Stimulus und Costimulus liefert.

Projekt Mitglieder

Protein-Micropatterning in der Plasmamembran lebender Zellen

Assistant Prof. Dipl.-Ing. Dr.techn.

Eva Sevcsik

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